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Fournisseur Audité Le Funoran, l'agarose et le porphyran appartiennent tous à l'agaran et partagent le même squelette. Bien que l' hydrolase glycoside pour l'agarose et le porphyrane, c.-à-d. l'agarase et la porphyranase, ait été étudiée de façon approfondie, l' enzyme hydrolysant le funoran n'a pas été rapportée jusqu'ici. La structure cristalline d'une β-agarase GH86 aga86A_Wa précédemment caractérisée a montré une grande cavité au sous-site −1, ce qui implique sa capacité à accueillir le groupe des esters sulfates. En utilisant des glycomiques et une analyse RMN, l'activité de l'Aga86A_Wa sur la structure caractéristique du funoran a été validée, ce qui a signifié la première découverte de l'hydrolase du funoran, c'est-à-dire la funoranase. L'Aga86A_Wa hydrolysait la liaison β-1,4 glycosidique entre le β-d-galactopyranose-6 sulfate (G6S) et l'unité 3,6-anhydro-α-l-galactopyranose (LA) du funoran, et libère le disaccharide LA-G6S comme produit final prédominant. Compte tenu du profil d'hydrolyse, nous avons proposé de nommer l'activité représentée par l'Aga86A_Wa sur le funoran "β-funoranase" et nous avons suggéré de lui attribuer un numéro ce.
Les agarans sont les principaux constituants de la paroi cellulaire de l'agarophyte, qui représentent une famille de galactans sulfatés solubles dans l'eau (Pomin & Mourao, 2008; Prado, Ciancia et Matulewicz, 2008). On a rapporté des polysaccharides chimiquement hétérogènes avec le squelette commun composé d'unités β-d-galactopyranose (G) et 4 α-l-galactopyranose (L) (G-L)n liées à 3 et contenant une différence subtile entre les différents polysaccharides (Pomin et Mourao, 2008). Actuellement, trois types d'agarans-agarose, funoran et porphyran-ont été étudiés de façon approfondie (Correc, Hehemann, Czjzek et Helbert, 2011; Hu et al., 2012; Lee et al., 2017).
Le funoran dérivé d'algues rouges comestibles du genre Gloiopeltis se forme de β-d-galactopyranose-6-sulfate (G6S) et de L cyclaté (3,6-anhydro-α-l-galactopyranose, LA) (G6S-LA)n (Hu et al., 2012; Takano, Hayashi, Hara, Et Hirase, 1995; Tuvikene et al., 2015). Il présente une répartition semblable avec l'agarose (G-LA)n, alors qu'il diffère de façon distinctive par l'occurrence de groupes de sulfate d'ester dans l'unité G. Le Funoran a déjà été utilisé commercialement en raison de ses propriétés fines, semblables à l'agarose et au porphyran (composé de G et de α-l-galactopyranose-6-sulfate (L6S)). Il a été largement appliqué comme adhésif dans les industries de la poterie et du textile (Takano, Iwane-Sakata, Hayashi, Hara et Hirase, 1998), et un épaississant sûr dans les industries alimentaires (Yu et al., 2010). En outre, elle a également été confirmée par diverses activités biologiques, notamment anti-inflammatoires (Keukenmeester, Slot, Putt et Van der Weijden, 2014), anti-tumorale (Bae & Choi, 2007) et antibactérien (Kurihara, Goto, Aida, Hosokawa et Takahashi, 1999), etc., qui a mis en évidence son potentiel en tant que polysaccharide fonctionnel comme d'autres polysaccharides sulfatés marins.
La dégradation enzymatique est une méthode spécifique et légère de dépolymérisation des polysaccharides et de production d'oligosaccharides (long et al., 2022). Les glycosides hydrolases ciblant l'agaran, précédemment caractérisés, ont été classés comme agarase (Park, Lee et Hong, 2020) et porphyranase (Hehemann et al., 2010). Selon le mode d'action, les hydrolases glycosides d'agaran rapportées ont été divisées en trois groupes, la β-agarase, la β-porphyranase et l'α-agarase. La β-agarase (EC 3.2.1.81) et la β-porphyranase (EC 3.2.1.178) catalysent l'hydrolyse de la liaison interne glycosidique β-1,4 dans l'agarose et le porphyrane, respectivement, tandis que l'α-agarase (EC 3.2.1.158) clivait la liaison glycosidique α-1,3 dans l'agarose (Chi, Chang et Hong, 2012). Néanmoins, l'enzyme pour hydrolyser le funoran n'a pas été clarifiée jusqu'ici, et le numéro EC particulier n'a pas été attribué.
Dans notre étude précédente, une β-agarase Aga86A_Wa appartenant à la famille 86 de la glycoside hydrolase (GH) de Wenyingzhuangia aestuarii OF219 a été caractérisée comme ayant une capacité de tolérance au méthyl-galactose (GME) en plus de l'unité G au sous-site −1 (CAO, Shen, Zue, Chang, Xhang, 2020). La structure cristalline de l'Aga86A_Wa combinée le résultat de l'amarrage moléculaire a révélé que la capacité de tolérance au méthyl-galactose pourrait être attribuée à la poche d'hébergement du sous-site −1 de l'Aga86A_Wa (Zhang et al., 2023). Selon cette découverte, nous avons observé en outre que la poche d'hébergement était beaucoup plus grande que l'espace requis pour les groupes méthyles. Compte tenu des caractéristiques de la structure chimique de l'agaran, nous avons donc spéculé que la poche d'hébergement pourrait accepter des groupes plus grands, comme le groupe d'ester de sulfate. Notre résultat moléculaire préliminaire a montré que le tétrasaccharide canonique du funoran pouvait s'adapter à la fente active d'Aga86A_Wa, et le G6S pouvait être adapté par le sous-site −1. Éclairé par la structure, nous avons cherché à vérifier la capacité de tolérance au G6S du sous-site −1 d'Aga86A_Wa, ce qui a permis d'élucider sa capacité d'agir sur la liaison glycosidique β-1,4 de l'épine dorsale du funoran.
Le sous-site −1 de l'Aga86A_Wa (PDB 8H97) est une cavité relativement grande. Pour étudier la capacité de tolérance au méthyl-galactose, le ligand tétrasaccharide (LA-G6Me)2 a été ancré dans la fente catalytique de la structure protéique d'Aga86A_Wa (Zhang et al., 2023). Le résultat de l'amarrage a montré que l'unité G6Me occupait l'intérieur de la cavité, tout en laissant un espace relativement énorme. Sur la base de la découverte, nous avons supposé que la cavité pourrait être capable d'accueillir des groupes encombrants plus grands que le méthyle
Au meilleur de nos connaissances, l'Aga86A_Wa est la première hydrolase de funoran recombinante rapportée jusqu'à présent. Il convient de mentionner qu'une enzyme de dégradation du porphyrane de type sauvage provenant de Zobellia uliginosa a été signalée avec une activité secondaire de dégradation du funoran (Howlader, Niroda, Bai, Premarathna et Tuvikene, 2022), alors que le type de la réaction catalytique n'était pas défini. Ici, nos résultats ont élucidé que l'Aga86A_Wa hydrolysait la structure caractéristique du funoran et catalysé la décomposition du
L'activité potentielle d'Aga86A_Wa sur la structure caractéristique du funoran a été validée dans ce travail. Aga86A_Wa agit sur le funoran et l'agarose, alors qu'il n'y avait aucune activité sur le porphyran. Il hydrolyse la liaison β-1,4 glycosidique dans G6Sβ1 → 4LA du funoran de manière endo-action aléatoire et libère le disaccharide LA-G6S comme composant prédominant des produits finaux. Nos résultats ont confirmé l'activité du funoran hydrolase pour la première fois, et l'activité contre le funoran représentée par
Le G. furcate séché a été acheté sur un marché (Guangzhou, Chine) et pulvérisé avant les procédures ultérieures. Des polysaccharides bruts ont été extraits de la poudre à l'aide d'eau chaude. Les résidus insolubles des algues ont été centrifugés à 4102 g pendant 20 min et éliminés. Le surnageant a ensuite été mélangé avec un volume d'éthanol 3 fois plus grand (95 % v/v) et centrifugé à 4102 g pendant 20 min pour récupérer les polysaccharides précipités. Le polysaccharide obtenu a ensuite été purifié sur le système ÄKTA Prime plus (GE
Ce travail a été soutenu par les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (202012020). Nous remercions le Centre de rayonnement synchrotron de Shanghai (SSRF) d'avoir fourni la plate-forme de collecte des données de diffraction.
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