Kit d′Elisa de résidus de fluoroquinolones pour œufs

• Protection environementale: Oui
• Certification: PORTÉE
• Couleur: blanc
• Classification: Food Diagnostic
• Fonction: Food Testing
• Apparence: Liquide
• N° de Modèle.: KA00906H
• Paquet de Transport: Foam Box with Ice Bag
• Spécifications: 96WElls
• Marque Déposée: KWINBON
• Origine: China
• Code SH: 38229000
• Capacité de Production: 50000PCS/Year

Description de Produit

 

 

Kit d'immunodosage enzymatique compétitif pour
Analyse quantitative des fluoroquinolones

 

 

1. Arrière-plan
Les quinolones (QNS) est une classe synthétique d'antibiotiques, qui agissent tous par inhibition de l'ADN gyrase, supprimant son activité en interférant avec la réaction de rejointure de l'ADN. La gyrase étant une enzyme essentielle des procaryotes, mais elle n'est pas présente chez les eucaryotes, les bactéries sont des cibles idéales pour ces antibiotiques. Dans la pratique vétérinaire, ils sont administrés par injection sous-cutanée au bétail, par voie intramusculaire aux porcs et par voie orale au bétail, aux porcs et au poulet pour le traitement des infections des voies respiratoires et alimentaires.
2. Principe de test
Ce kit ELISA est conçu pour détecter les quinolones en se basant sur le principe d'un immunodosage enzymatique compétitif. Les puits de microtitration sont recouverts d'antigènes de capture liés à la BSA. Les quinolones de l'échantillon sont en concurrence avec l'antigène recouvert sur la plaque de microtitration de l'anticorps. Après l'ajout d'un conjugué enzymatique, on utilise un substrat chromogène et le signal est mesuré par spectrophotomètre. L'absorption est inversement proportionnelle à la concentration de quinolones dans l'échantillon.
3. Applications
Ce kit est utilisé pour l'analyse quantitative et qualitative des fluoroquinolones dans les tissus (porc, canard, chèque, poisson, crevettes) lait, lait en poudre et oeuf.
4. Réactions croisées
Norfloxacin(NOR) ….................. …..…..100%
Difloxacin(DIF).................. …........ 197 %
Enrofloxacine (ENR)........................ 160 %
Fluméquine (GRIPPE)…................... …...155 %
Sarafloxacine (SAR).................. ….…..175%
Danofloxacin(DAN)...................... ….120%
Pefloxacin (PEF).................... …........ …...205 %
Ciprofloxacine(CIF), etc. …120 %
Enoxacin(ENO)...…............ …........ ….65%
Ofloxacine (OFL).................... …....... 70 %
Lévofloxacine (LVX)..................... …...7 %
Acide oxolinique (OXO) …..... …...…13%
Lomefloxacin (LOM)... ….......... …...8 %
Marbofloxacine (MAR)............... ….... 4 %
5. Matériel requis
5.1 Equipements
---spectrophotomètre pour plaque de microtitration (450 nm/630 nm)
---évaporateur rotatif ou instruments de séchage à l'azote
---Homogenizer / Stomacher
---Shaker
---mélangeur Vortex
---centrifugeuse
---Balance analytique (inductance: 0,01g)
---pipette graduée: 10ml
---poire pour pipette en caoutchouc
---fiole jaugée: 100ml, 400ml, 500ml
---tube à essai en verre : 10 ml
---tube à centrifuger en polystyrène : 2 ml, 15 ml, 50 ml
---micropipettes: 20ul-200ul,
multipipette 100 μl-1000 ul, 250 μl
5.2 réactifs
---acétonitrile anhydre(AR)
---n-hexane(AR)
---acide chlorhydrique concentré(HCl, AR)
---eau désionisée
6. Composants du kit

1. Plaque de microtitration avec revêtement antigénique, 96 puits.
2. Solutions standard×6 flacons : (1 ml/flacon)

0 ppb, 0,1 ppb, 0,3 ppb, 0,9 ppb, 2,7 ppb, 8,1 ppb

1. Solution étalon de dopage : 1 ml, 100 ppb
2. Conjugué enzymatique concentré (1 ml)….....capuchon rouge
3. Solution d'anticorps (7 ml).........…bouchon ....green
4. Solution de substrat A (7 ml).............bouchon blanc
5. Solution de substrat B (7 ml)............…capuchon rouge
6. Solution d'arrêt (7 ml)...............…bouchon jaune
7. 20×solution de lavage concentrée (40 ml)

 capuchon transparent

1. 2×solution d'extraction concentrée (50 ml)  

......................…......capuchon bleu
7. Préparation des réactifs
Solution 1 : HCL 0,15 M.
Diluer 5 ml d'acide chlorhydrique concentré avec 400 ml d'eau désionisée, mélanger complètement.
Solution 2 : solution d'acide trichloracétique à 3 %
      Poids 3,0 g d'acide trichloroacétique, diluer avec 100 ml d'eau désionisée, complètement dissoute.
Solution 3 : SOLUTION D'acide sulfurique 2 M.
    Poids 11,1 ml d'acide sulfurique concentré à 98.3 %, ajouter de l'eau désionisée à volume constant à 100 ml, mélanger complètement.
Solution 4 : tampon d'échantillon
     Mélanger complètement 10 ml de HCl 0,15 M (solution 1) avec 90 ml d'acétonitrile anhydre.
Solution 5 : solution d'extraction
Diluer la solution d'extraction concentrée 2×avec de l'eau désionisée (1:1), qui sera utilisée pour diluer les échantillons.
Solution 6 : solution de lavage
Diluer la solution de lavage concentrée de 20×avec de l'eau désionisée(1:19), qui sera utilisée pour laver la plaque. La solution de lavage peut être conservée pendant un mois à 4ºC.
8. Préparation des échantillons
8.1 Avertissement et précautions avant utilisation
(A) Veuillez utiliser des embouts en une seule opération au cours de l'expérience et changer les embouts lors de l'absorption d'un réactif différent.
(b) Veuillez vérifier si tous les outils expérimentaux sont propres et purifier si nécessaire, ce qui empêche d'interférer avec les résultats.
(c) conserver l'échantillon non traité dans un gel.
(d) l'échantillon traité peut être conservé pendant 24 heures, à 2-8ºC à l'obscurité, sauf pour le sérum.
(e) le conjugué enzymatique doit être préparé à l'avance.

8.2 tissus (poulet, porc, canard, poisson, crevettes, etc.)
----homogénéiser l'échantillon avec un homogénéiseur.
----peser 2,0g±0.05 de l'homogénat dans un tube à centrifuger en polystyrène de 50 ml, ajouter 8 ml de tampon d'échantillon (solution 4), agiter pendant 3 min, puis centrifuger : 3000g, 5 min, température ambiante.
----transférer 2 ml de la phase organique surnée dans un tube à essai propre et sec, puis évaporer pour sécher avec un bain d'eau sous un flux d'azote de 50-60ºC.
----dissoudre le résidu avec 1 ml de n-hexane, passer au vortex pendant 2 min pour dissoudre, puis ajouter 1 ml de solution d'extraction (solution 5), puis au vortex pendant 30 s.
----centrifugeuse : 3000g, pour 5 min, température ambiante.
----retirer la phase organique du surnageant, prendre 50 μl de la solution de substrat par puits pour le dosage.

Facteur de dilution :               2

8.2 lait
----poids 1ml d'échantillon de lait dans un tube centrifuge en polystyrène de 10ml, ajouter 1ml de solution d'acide trichloroacétique à 3% (Soluton 2),vertex 1min,mélanger complètement, centrifuger: 3000g, pour 5min, température ambiante.
----éviter la couche de graisse supérieure et enlever 100 ml de surnageant dans un tube centrifuge en polystyrène de 2 ml, ajouter une solution d'extraction de 900 ul (solution 5), vortex pendant 1 min pour mélanger complètement.
----prendre 50µl par puits pour le dosage.

Facteur de dilution :                     20

8.3 lait en poudre
----poids 1±0,05g d'échantillon de poudre de lait dans un tube centrifuge en polystyrène de 10 ml, ajouter 5 ml d'eau désionisée, vertex 2min, mélanger complètement .
---- Prélever 1 ml de solution de lait en poudre dans un tube centrifuge en polystyrène de 2 ml, ajouter 20 ul de solution d'acide sulfurique 2 m (Soluton 3), vertex 2 min, mélanger complètement, centrifuger : 3 000 g, pendant 5 min, température ambiante.
----éviter la couche de graisse supérieure et enlever 100 ml de surnageant dans un tube centrifuge en polystyrène de 2 ml, ajouter une solution d'extraction de 900 ul (solution 5), vortex pendant 2 min pour mélanger complètement.
----prendre 50µl par puits pour le dosage.

Facteur de dilution :                        50
8.4 œuf
---poids 1.0±0,05g matériau d'échantillon homogène pour tube centrifuge en polystyrène de 10 ml.
---- Ajouter 5 ml d'eau désionisée, utiliser un oscillateur pour dissoudre complètement.
----prélever un échantillon de 100ul, ajouter une solution d'extraction de 400ul (solution 5),vertex 1min jusqu'à ce que le mélange soit complètement.
---prendre 50ul pour le dosage.
Facteur de dilution :                        30
9. Étapes de dosage
9.1 Avis avant le dosage
9.1.1 conserver tous les réactifs et les micro-ondes à température ambiante (20 ºC) pendant plus de 30 min jusqu'à ce qu'ils soient réchauffé.
9.1.2 remettre tous les autres réactifs à 2-8ºC immédiatement après utilisation.
9.1.3 le lavage correct des micro-ondes est un point important du processus de dosage, c'est un facteur essentiel pour la reproductibilité de l'analyse ELISA
9.1.4 couvrez les micro-puits pendant l'incubation.
9.2 processus de dosage
9.2.1 amener tous les réactifs à température ambiante (20 ºC) pendant plus de 30 min et agiter doucement avant utilisation.
9.2.2 sortez les micro-ondes nécessaires et replacez le reste dans le sac à fermeture à glissière et entreposez-le immédiatement à 2-8ºC.
9.2.3 Numéro: Insérer un nombre suffisant de puits dans le porte-micro-puits pour que tous les étalons et échantillons soient analysés en double. Noter la position des étalons et des échantillons.
9.2.4 Ajouter un échantillon / un étalon : ajouter 50 µl de chaque solution étalon (composant du kit) ou d'un échantillon préparé pour séparer les puits en double.
9.2.5 mélanger l'anticorps et le conjugué enzymatique : mélanger l'anticorps (composant du kit) et le conjugué enzymatique (composant du kit) dans le rapport de volume de 10:1 selon votre utilisation (par ex. 3 ml d'anticorps + 0,3 ml de conjugué enzymatique), mélanger complètement (le mélange ne peut pas être conservé, utiliser immédiatement).
9.2.6 Ajouter le mélange d'anticorps et de conjugué enzymatique : ajouter immédiatement 50 µl du mélange conjugué anticorps-enzyme dans chaque puits, mélanger doucement et incuber pendant 30 min à 25 ºCavec le couvercle.
9.2.7 lavage : retirer doucement le couvercle et éliminer le liquide des puits et laver les micro-puits avec 250 µl de solution de lavage diluée (solution 6) à des intervalles de 10 s. Tapotez le support pour micro-ondes à l'envers vigoureusement contre le papier absorbant pour éliminer complètement le liquide des puits (répétez l'opération 4-5 fois).
9.2.8 coloration : ajouter 50 µl de solution A (composant du kit) et 50 µl de solution B (composant du kit) dans chaque puits. Mélanger doucement et incuber 15 min à 25ºCavec couvercle (voir 12.8).
9.2.9 mesure : ajouter 50 µl de la solution d'arrêt (composant du kit) dans chaque puits. Mélanger doucement et mesurer l'absorbance à 450 nm par rapport à un blanc d'air (il est conseillé de mesurer avec la longueur d'onde double de 450 / 630 nm, lire le résultat dans les 5 min après avoir ajouté la solution d'arrêt)
10. Résultats
10.1 % d'absorbance
Les valeurs moyennes des valeurs d'absorbance obtenues à partir des étalons et des échantillons sont divisées par la valeur d'absorbance du premier étalon (étalon zéro) et multipliées par 100 %.
  =
B --absorbance des étalons ou des échantillons
B0 --absorbance de l'étalon zéro
10.2 courbe standard
---pour tracer une courbe standard : la valeur d'absorbance des étalons comme axe y, semi-arithmétique de la concentration des étalons (ppb) comme axe x.
---la concentration de fluoroquinolones de chaque échantillon (ppb), qui peut être lue à partir de la courbe d'étalonnage, est multipliée par le taux de dilution correspondant de chaque échantillon suivi, et la concentration réelle de l'échantillon est obtenue.
Avis : un logiciel spécial a été développé pour le calcul des résultats, qui peut être fourni sur demande.
11. Sensibilité, précision et précision
11.1 sensibilité de test : 0,1 ppb
11.2 limite de détection
Norfloxacin(NOR)…................... …..…0,2ppb
Difloxacin(DIF)........................ …0,2ppb
Enrofloxacine (ENR)...................... 0,2 ppb
Fluméquine (GRIPPE)…................... ….0.2ppb
Sarafloxacine (SAR)..................... ….0.2ppb
Danofloxacin(DAN)............... …...... 0,2 ppb
Pefloxacin (PEF).................... …...... …..…..0.2ppb
Ciprofloxacine(CIF) ... …0,3ppb
Enoxacin(ENO)...….................... …0,3ppb
Ofloxacine (OFL).................. …......0,3ppb
Lévofloxacine........................... 0,3 ppb
Acide oxolinique (OXO), etc. …0,6ppb
11.3 limite de détection de l'échantillon
Tissu........................... …..0.3ppb
Lait................................ …3ppb
Lait en poudre............................ …6ppb
Œuf.............................................................................. 3 ppb
11.4 précision
Tissu............ …....... ….... 100 %±30 %
Lait...................... ….... 95 %±25 %
Lait en poudre.................. ….... 95 %±25 %
Œuf................................................................... 100 %±30 %
11.5 précision
CV du kit ELISA tous inférieurs à 10%.
12. Avis
12.1 les valeurs moyennes des valeurs d'absorbance obtenues pour les étalons et les échantillons seront réduites si les réactifs et les échantillons n'ont pas été réglés à la température ambiante (20-25ºC).
12.2 ne laissez pas les micro-ondes sécher entre les étapes pour éviter toute répétition infructueuse et passez à l'étape suivante immédiatement après avoir tapoté le support pour micro-ondes.
12.3 mélanger l'homogénat et éluer la plaque de manière adéquate. 12.4 éviter que la solution d'arrêt ne touche la peau car elle est de 2 M    H2SO4.
12.5 n'utilisez pas les kits obsolètes. Ne pas échanger les réactifs de différents lots, sinon la sensibilité sera plus élevée.
12.6 conserver les kits ELISA à 2-8ºC. Éviter la lumière directe du soleil pendant toutes les incubations. Il est recommandé de recouvrir les plaques de microtitration.
12.7 la solution de substrat doit être abandonnée si elle change de couleur. Les réactifs peuvent être détériorés si la valeur d'absorbance (450/630 nm) de l'étalon zéro est inférieure à 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 la réaction de coloration nécessite 10 à 15 min après l'ajout de la solution A et de la solution B, mais vous pouvez prolonger la durée d'incubation à 20 min si la couleur est trop claire pour être déterminée. Ne jamais dépasser 25 min. Au contraire, raccourcir correctement le temps d'incubation.
12.9 la meilleure température de réaction est de 25 ºC, une température trop élevée ou trop basse entraîne des changements de sensibilité et de valeurs d'absorbance.